通过式高效净化-超高效液相色谱-串联质谱测定猪肉、猪肝及其脂肪组织中21种三唑类杀菌剂

摘 要 建立了猪肉、猪肝及其脂肪组织中21种三唑类杀菌剂的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。样品经乙腈提取，浓缩后加水混匀， 经PRiME HLB柱净化，收集流出液， 用UPLC-MS/MS法测定，基质标准曲线定量。21种三唑类杀菌剂在0.5～100 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99; 在3个添加浓度（2.0、5.0和10.0 μg/kg） 下，各杀菌剂的回收率为69.5%～109.5%，相对标准偏差为0.4%～10.8%。 此方法前处理操作简便，灵敏度高， 精密度好，能较大程度除去基质干扰，可用于猪肉、猪肝及其脂肪组织中21种三唑类杀菌剂残留的测定。

关键词 超高效液相色谱-串联质谱; 猪肉; 猪肝; 猪脂肪; 三唑类杀菌剂

1 引 言

三唑类杀菌剂为有机杂环类化合物，结构主链上含有羟基（酮基）、取代苯基和1，2，4-三唑基团，作为一类高效、低毒、广谱的杀菌剂[1]， 广泛用于蔬菜、水果、稻谷作物等种植与病虫害防治[2]，但同时也造成其在蔬菜、水果、农作物、土壤和水体[3～5]中残留，影响食品质量安全并造成环境污染[6]。残留的杀菌剂及其代谢物可通过食物链传递，在动物组织中富集、累积，使畜禽产品也存在安全隐患，对消费者的健康造成威胁。日本“肯定列表制度”[7]及国际食品法典委员会（CAC）[8]针对畜禽产品中的部分三唑类杀菌剂设定了最大残留限量（MRL），范围在0.01～2.00 mg/kg之间。我国食品安全标准GB2763-2016中仅规定了部分三唑类杀菌剂在植物性食品中的限量标准[9]，尚未对动物性食品中残留作限定。

目前，文献报道的关于三唑类杀菌剂残留的测定主要集中在水体、土壤及水果、蔬菜等植物性样品，样品净化通常采用QuEChERS方法[10～12]、固相萃取方法（SPE）[13～17]或分散液液微萃取法（DLLME）[3，18，19]等，检测方法有气相色谱法[14]、液相色谱法[16，17]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[13～15，18]和液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）[17，19]等。现行关于三唑类杀菌剂的检测技术标准[20～22]涉及的基质以粮谷类、果蔬等植物性食品为主，净化方式均采用固相萃取技术，关于畜禽产品中三唑类杀菌剂的检测方法较少，缺乏相应完善的检测技术标准。对于动物性食品的残留分析方法通常采用较为繁琐的SPE柱净化或QuEChERS法结合其它技术，Souza等[23]通过改良QuEChERS法结合冷冻除脂后用HPLC-MS/MS和GC-MS检测肝脏、肌肉中的兽药和杀虫剂。吕冰等[24]采用乙腈提取，以凝胶渗透色谱和Carb-NH2萃取柱联合净化， 建立肉类、水产类等动物性食品中167种农药残留的气相色谱-串联质谱检测方法。本研究将针对猪肉、猪肝、猪脂肪基质中脂肪、蛋白含量高，采用通过式过柱法去除脂肪和磷脂，净化效率高、操作简便，结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定，方法灵敏度高、重复性好，可以满足畜禽产品中三唑类杀菌剂的测定要求，为动物源食品的残留监测与控制提供技术支撑。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UPLC-MS/MS配置包括LC 30AD超高壓液相色谱（日本Shimadzu公司）与6500 QTRAP质谱（美国Applied Biosystems公司），并配备Multiquant 3.0数据处理软件; 固相萃取装置（美国Supelco公司）; Talboys230v涡旋混合器（美国Troemner公司）; SorvallPrimoR高速冷冻离心机（美国Thermo公司）; KQ5200B超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）; 分析天平（德国Sartorius公司）; Turbovap LV氮吹浓缩仪（瑞典Biotage公司）; 组织捣碎机（荷兰Philips公司）。

固相萃取柱为Oasis  PRiME HLB（200 mg，6 mL，Waters公司）。甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）。甲酸铵（色谱纯，迪马公司）。实验用水为超纯水（美国Millipore公司）。三唑类杀菌剂标准品（纯度均≥98%，名称见表1）购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

准确称取按其纯度折算为100%质量的21种三唑类杀菌剂标准品各10 mg，分别用甲醇溶解并定容至100 mL，浓度为100 mg/L，储备液储存于20℃，有效期为12个月。用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准工作溶液，混合标准工作溶液保存于4℃，现配现用。

2.2 样品处理

2.2.1 样品制备 猪肉、猪肝和猪脂肪样品购自本地农贸市场，样品先切碎成小块，随后用组织捣碎机捣碎成匀浆，置于分装袋中， 20℃下保存备用。

2.2.2 样品前处理 称取5 g（精确到0.01 g）试样至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混合，超声提取5 min，以8000 r/min离心3 min，收集上清液，残渣用10 mL乙腈进行二次提取。合并两次提取液，于50℃水浴中氮吹至4 mL，然后用水定容至5 mL，涡旋混匀，过PRiME HLB柱净化，重力作用下，收集全部流出液。取1 mL流出液，以水定容至2 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

2.3 色谱和质谱条件

色谱条件： BEH-C18柱，（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm， Waters公司）; 柱温：  40℃; 进样量： 5 μL; 流速： 0.2mL/min; 流动相A为2 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸），流动相B为甲醇，梯度洗脱程序： 0～1 min，70% A; 1～1.1 min，70%～40% A; 1.1～3 min，40% A; 3～8 min，40%～10% A; 8～12 min，10% A; 12～12.1 min，10%～70% A; 12.1～15 min，70% A。

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