苏云金芽孢杆菌及vip基因在不同自然环境中分布情况的比较

摘要：营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein，简称VIP）是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在营养期表达的一类新型杀虫毒蛋白，该蛋白的发现使得Bt杀虫剂在杀虫活性、杀虫范围方面得到很大突破。首次比较我国不同气候类型（热带：海南省，亚热带：广西壮族自治区，温带：黑龙江省）的Bt菌株和vip基因的分布情况。结果表明，从海南省841份土样中分离出156株Bt菌（18.55%），从广西地区1 420份土样中分离出356株Bt菌（25.07%），从黑龙江省1 010份土样中分离出167株Bt菌（16.53%）；从海南省的156株Bt菌中鉴定出22个vip基因（占14.1%），从广西地区的356株Bt菌中鉴定出2个vip基因（占5.62%），然而，从黑龙江省的156株Bt菌中没有鉴定出vip基因（0%）。利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）方法成功克隆出1个[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]的全长基因并获得登录号KT792883，将该基因插入到表达载体pET-21b中，转化菌株Rosetta（DE3），在低温条件下表达88 ku的蛋白，将该蛋白进行生物活性测定，结果显示，该蛋白对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）具有较好的杀虫活性，LC50为5.124 ng/mg，对棉铃虫（Heliothis armigera）活性較低，LC50为870.1 ng/mg。研究结果显示，Bt菌株和vip基因的分布有地域性差异，在温度较高的热带、亚热带地区有比较丰富的Bt菌株和vip基因资源。研究将有利于充分利用土壤中的Bt菌株，分离具有自主知识产权和重要应用价值的新型vip抗虫基因，这将会为研究新型杀虫蛋白、延缓害虫抗性问题提供有益帮助。

关键词：苏云金芽孢杆菌；vip基因；鉴定；气候类型；生物活性测定

中图分类号： Q938.1+1文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）04-0018-04

虫害是影响粮食产量的一个重要因素，目前广泛应用的化学杀虫剂对非靶目标有很大的毒性且不易降解。生物杀虫剂可作为化学杀虫剂的替代品，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）便是目前广泛应用的环境友好型生物杀虫剂[1]。苏云金芽孢杆菌在生长代谢过程中可以产生多种对昆虫有致病性的杀虫毒素，其中δ-内毒素（deltaendotoxin）以蛋白质结晶的结构形式存在于细胞内，并随芽孢的释放而释放到胞外（如Cry、Cyt）。晶体蛋白对多种昆虫具有特异的杀虫活性，如对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目有很高毒力，此外对线虫也有毒性作用[2]。由于Bt蛋白对靶生物有很高的活性且对非靶生物无害[3-5]，已经有实验室发掘Bt菌株和新型杀虫蛋白来扩大转基因植物杀虫谱和延缓害虫抗性[6-9]。

VIP蛋白最早由Estruch等于1996年从苏云金杆菌菌株AB88上清液中发现的[10]。营养期杀虫蛋白主要被分为四大家族：Vip1、Vip2、Vip3、Vip4（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html）。VIP蛋白与δ-内毒素家族没有同源性，且对鳞翅目[10]、鞘翅目[11]、同翅类[12]有活性；Vip3Aa蛋白氨基酸的同源性大于95%，且对鳞翅目昆虫有很好的活性。个别氨基酸的差异可能会导致杀虫活性、杀虫范围的改变[5]。Vip蛋白代表杀虫转基因的第2代，在苏云金芽孢杆菌抗性方面，Vip3蛋白是最适合的替代者，在一定程度上克服了许多害虫对Bt内毒素低敏感或不敏感的弊端，它会提供一个范围更大的杀虫谱来缓解Cry蛋白产生的抗性问题[1，10，13-15]。

海南省位于中国南端，地处热带北缘，属热带季风气候，素来有“天然大温室”的美称，这里长夏无冬，年平均气温 22～27 ℃；广西壮族自治区位于中国华南地区西部，属亚热带季风气候区，年平均气温在16.5～23.1 ℃之间；黑龙江省位于欧亚大陆东部、太平洋西岸、中国最东北部，气候为温带大陆性季风气候，全省年平均气温多在-5～5 ℃之间。在本研究中，笔者比较了属于不同气候类型的海南、广西、黑龙江的Bt菌株和vip基因的分布情况，以期为Bt菌株和vip基因的发掘提供一定的理论依据，这将有助于人们充分利用土壤中极其丰富的微生物资源，发掘具有较好杀虫特异性、较高杀虫活性的新型杀虫蛋白，为害虫抗性治理提供优质基因资源。

1材料与方法

1.1材料

菌株与载体：Bt菌株，由笔者所在实验室分离并保存；pET-21b质粒和大肠杆菌JM109、Rosetta菌株，由笔者所在实验室保存。

主要试剂：Taq DNA聚合酶、KOD酶、氨苄青霉素（Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）、异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyrano-side，IPTG）、蛋白质分子量标准，均购自TaKaRa公司。PCR产物回收DNA试剂盒、质粒提取试剂盒，购自美国Axygen公司。供试昆虫，购自科云生物公司。

1.2方法

1.2.1Bt菌株的分离及鉴定分别从海南、广西、黑龙江采集土样，将采集的土样通过高温筛选的方法进行Bt菌株分离。在50 mL离心管内加入1 g土样、20 mL灭菌水，80 ℃ 恒温水浴30 min，静置30 min后将上清液稀释100倍，取 200 μL 涂到1/2LB培养基上，30 ℃培养48 h，通过显微镜镜检。

1.2.2引物设计与合成根据[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]保守区的碱基序列，利用Primer 5软件设计出用于vip基因鉴定的引物对 vip3a/vip3s。根据已知的[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]基因的序列设计全长引物vip3F/vip3R，并在上游引物中引入SalⅠ酶切位点，下游引物中引入Xho

1.2.4[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]类全长基因的克隆及表达用[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]基因的全长引物vip3F/vip3R进行PCR扩增。反应体系：25 μL KOD，各1 μL上、下游引物，1 μL模板，22 μL ddH2O。扩增循环：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用限制性内切酶SalⅠ、XhoⅠ双酶切PCR全长产物、载体pEB21b，连接、转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选单克隆进行验证，委托哈尔滨博仕生物技术有限公司测序。测序结果在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上进行在线Blast比对，测序结果确定正确后提取重组子的质粒，转化到大肠杆菌Rosetta，在含有氨苄抗生素（50 mg/mL）的LB固体培养基上进行培养。挑取单克隆进行验证，将验证正确的单克隆在LB液体培养基中于37 ℃摇床培养，待D600 nm为0.6左右时，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，置于16 ℃摇床中过夜培养。离心收集菌体，将菌体悬浮于20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）缓冲液中，超声波破碎细胞5 min，10 000 r/min 离心10 min，将沉淀重新悬浮于20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）缓冲液中，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白的表达情况。

1.2.5生物活性测定用National Institutes of Health开发的Image J软件分析SDS-PAGE图谱来对蛋白进行定量。将粗蛋白进行浓度梯度稀释，以pET-21b空质粒的Rosetta为阴性对照，测定粗蛋白对甜菜夜蛾的毒力。称取 10 g 人工饲料置于灭菌培养皿中，加入1 mL待测样品稀释液，充分混匀，分装于24孔细胞培养板中。用毛笔接入甜菜夜蛾初孵幼虫，每孔1头，每个处理重复3次，置于27 ℃光照培养箱中，培养 7 d 后调查死、活虫数[16-17]。

2结果与分析

2.1Bt菌株的分离及vip基因的鉴定

通过高温筛选法从海南省的841份土样中分离出156份Bt菌株，广西地区的1 420份土样中分离出356份Bt菌株，黑龙江省的1 010份土样中分离出167份

的重组子转化到Rosetta进行培养，诱导蛋白表达。SDS-PAGE检测结果表明，在约88 ku处有1条电泳带，与预期的目的蛋白相符，说明Vip3Aa蛋白成功表达（图4）。

2.3生物活性测定的结果

将粗蛋白（Bt总蛋白）进行浓度梯度稀释，以pET-21b空质粒的Rosetta为阴性对照，测定粗蛋白对甜菜夜蛾、棉铃虫的毒力，培养7 d后调查死、活虫数。初筛结果显示，粗蛋白对甜菜夜蛾有一定毒力。进一步对该蛋白进行复筛，表明 pET-[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]对甜菜夜蛾生测的LC50为3讨论

目前Bt已成为世界上应用最广泛的微生物杀虫剂，VIP是在Bt菌株营养期生长的一类杀虫蛋白家族。已报道的VIP蛋白具有杀虫作用，它可提供范围更大的杀虫谱。目前Bt菌株主要是从土壤中分离，因此笔者从具有不同代表性气候条件的地区，如海南省、广西地区、黑龙江省采集了土壤样品，利用高温筛选法进行Bt菌株的分离，利用PCR对vip基因进行鉴定。已有报道对同一地区vip基因分布进行调查，但到目前为止，尚无报道热带、亚热带、温带地区的Bt菌株、vip基因的分布情况。本研究首次对上述3个地区的Bt菌株和vip基因的分布情况进行统计比较，结果表明，与温带地区相比较，热带、亚热带地区有更丰富的Bt菌株和vip基因资源。

苏云金芽孢杆菌广泛存在于土壤、水、污物等环境中，土壤中含有丰富的微生物，给Bt的生存提供良好的环境[18]。有报道指出，温度较高的地方苏云金芽孢杆菌的含量也较高。巴郎山、峨眉山的自然环境与其他地方不同，温度、含氧量都很低，常年被积雪覆盖，Bt的出菌率明显低于四川省的其他地方[19]。还有一些研究表明，俄罗斯Caspianic地区的出菌率是7%，比寒冷地区（5.7%）、干燥地区（5%）的出菌率高[15]。本研究选择了3个具（热带、亚热带和温带），对Bt菌株和vip基因资源进行分析比较。海南省位于中国南端，海南岛地处热带北缘，属热带季风气候，土壤类型属于砖红壤、赤红壤；广西地区位于中国华南地区西部，属亚热带季风气候区；黑龙江省位于欧亚大陆东部、太平洋西岸，地处中国最东北部，气候为温带大陆性季风气候，土壤有机质含量高于其他地方，是世界三大黑土地之一。这3个地区具有明显的气候差异，而土壤属于半开放的生态系统，易受环境影响。南方高温多雨，土壤微生物种类丰富，为细菌的生长、繁殖提供了有利条件；而北方寒冷干旱，芽孢存活力差，这可能是导致Bt菌株分布情况不同的原因。

而对于vip基因分布情况的不同，笔者认为这与基因进化有关。基因在遗传过程中具有保守性，在某些条件下，例如温度的变化、地理位置变迁等，一些基因的位置将会发生变化。开始这种变化是微小的，不同的环境和不同的积累，会导致基因向不同方向进化，这可能是在不同气候条件下vip基因分布情况不同的原因；另外，笔者所在实验室一直在进行cry基因的挖掘工作，发现cry基因数量并没有像vip基因那样存在较大地域性差异。因此，笔者也推測vip基因在进化过程中更易受到各种自然环境因素的影响，如温度、植被类型、昆虫种类等；vip基因与cry基因的杀虫谱及杀虫作用机制的不同可能也与这种进化差异有关，具体原因还有待进一步研究。由于VIP蛋白与CRY蛋白作用于昆虫的受体不同[10]，因此VIP蛋白可为CRY蛋白抗性提供管理策略，然而，土壤中含有的丰富vip基因资源还没有被发掘，那么寻找新的vip基因就尤为重要。目前，PCR技术被广泛应用到vip基因的鉴定[20-21]。本研究用鉴定引物vip3a/3s和PCR的方法，鉴定出1个新型[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]基因。结果表明，此方法可以用于vip基因的鉴定和新基因的发掘。

本研究的生物活性测定结果显示，表达产物对甜菜夜蛾有明显杀虫作用。本研究首次对热带、亚热带和温带地区的Bt菌株和vip基因的不同分布进行比较，结果显示，热带、亚热带具有丰富的Bt菌株和vip基因资源，随着温度的降低，Bt菌株、vip基因的数量也隨之减少，因此笔者建议在热带、亚热带及温度较高的地区进行Bt菌株、vip基因的发掘，这将会为探索和发掘新型vip基因提供帮助。

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