双分子标记法的构建及在中药研究中的应用

总结了该方法所具备的技术优势，展望了其在中药多来源药材的鉴别研究、年限鉴别研究、产地鉴别研究、优良种质研究、新的药物资源的寻找和开发及中药植物新品种保护中的重要应用。作为中药材二维分子标记法的补充，双分子标记法的提出，将进一步促进分子水平对中药的真伪鉴定及质量优劣评价研究的发展。

[关键词]双分子标记法;DNA分子标记;代谢标识物;真伪;优劣

Hypothesis and application of bimolecular marking methods in

Chinese materia medica

HUANG Lu-qi1*， QIAN Dan²， DENG Chao³

（1.State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China;

2.Experimental Research Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China;

3. Science and Technology Development Center， Ministry of Agriculture， Beijing 100122， China）

[Abstract]Based on the current shortage of genuine/false authentication and quality evaluation in the molecular identification， and the weak functional gene research in the establishment of two-dimensional molecular markering methods for Chinese materia medica， the authors proposed a new method， the bimolecular marking methods （BIMM） for Chinese materia medica， combining DNA marker and metabolomics marker， that could simultaneously research the species and quality differences at the molecular level at the present stage. The authors introduced the concept， principle， methods， and technical process of BIMM， and summarized the technical advantages in this paper. Meanwhile， the application of BIMM in the identification of multiple sources of Chinese materia medica， years-identification， different locations， elite germplasm research， discovery of new drugs resources，protection of new varieties was also discussed. As a supplement of two-dimensional molecular markering method for Chinese materia medica， BIMM would not only expand connotation of identification of Chinese materia medica but also provide another effective way for quality evaluating.

[Key words]bimolecular marking methods; DNA marker; metabolomics marker; genuine/false; quality

doi：10.4268/cjcmm20150201

笔者2012年提出了中药“真伪、优劣”二维分子标记法及其策略构想，以期在分子水平同时解决中药“真伪、优劣”评价的2个核心问题^[1]。经过近3年的研究实践，发现“优劣”鉴定方面的功能基因研究难度较大，导致该方法研究进展缓慢，而随着代谢标识物研究快速发展，为上述策略构想的实施提供新的方向和支撑，为此本文提出了双分子标记法及其构想，以期促进二维分子标记法构建，从分子水平对中药的真伪优劣进行鉴定及评价研究的进一步发展。

1双分子标记法的构建

1.1双分子标记法的提出目前，中药鉴定与评价的分子标识主要侧重于单一DNA分子标记对中药不同种属间的鉴别（黄芪^[2]、川贝母^[3]、洋金花^[4]等）及对不同居群间的遗传多样性的分析，或根据单指标化学成分评价同一中药不同来源、不同产地、不同发育阶段的质量差异。但由于中药的原植物生物进化机制复杂，杂交、基因转移、多倍化现象、栽培种质混杂等会导致DNA序列信息在一些物种间没有鉴别力或产生错误的鉴定结论。中药是多成分的复杂体系，通过单一或部分指标性成分来评价其质量优劣，无法体现其整体效应，存在一定局限性。

双分子标记法（bimolecular marking methods，简称BIMM）是基于DNA分子标记和代谢标识物相结合的分析方法，在分子水平同时研究中药的种类、区别和质量差异的一种分子标记方法。DNA分子标记用于中药物种的遗传信息分析，代谢标识物的定性及定量分析完成对中药物质基础的评价。

1.2双分子标记法的原理与方法DNA分子标记是指能反映中药物种个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，主要来源有核糖体基因ITS，18S，叶绿体基因如matk，rbcL，psbA-trnH，trnL-trnF等，动物中线粒体COⅠ基因的DNA序列信息。目前获得DNA分子标记的主要技术方法包括RFLP，AFLP，RAPD，ISSR，SRAP，SSR，基于DNA序列分析的SNP及测序等。

中药的代谢产物是治疗疾病的物质基础，是人类药物的重要来源。代谢产物的研究及其质量优劣关系到用药的有效性、安全性及稳定性。中药植物药中有效成分多为其次生代谢产物，动物药中多为初生代谢产物。中药代谢产物成分复杂，具有评价中药质量的代谢产物是代谢标识物。目前多以单指标代谢标识物评价中药质量，该方法操作性强、相对有效，但也存在不足：个别或部分代谢标识物难以体现其整体效应。随着代谢组学高通量、高灵敏度和高精准度的各种谱学分析技术的发展，这种无选择性的接近全景代谢物的分析使得不同来源、不同产地、不同年限、不同部位等中药的代谢标识物-主要活性化合物或者代谢中间产物的发现成为可能。

根据不同的研究对象，筛选合适的DNA分子标记，通过对其多态性的分析，获取不同研究对象的特征DNA序列。应用LC-MS，GC-MS，Tof-MS和QTof-MS等分析仪器对中药进行全景代谢谱测定，通过应用多种统计分析手段（如主成分分析、聚类分析等）分析来自不同类别的中药的数据，寻找可以有效区分其类别的标识性化合物。综合比较DNA分子标记与代谢标识物分析的关系，建立与药材品质紧密连锁的双分子标记技术平台。双分子标记法结合基因组和代谢组2个方面进行研究，将中药的遗传信息多态性与其表型性状化学成分的定性与定量分析相结合，不仅从DNA序列信息上找出差异，亦结合其代谢物的有无和含量差异，进行中药的鉴定与质量评价，双分子标记法技术流程图见图1。

图1双分子标记法技术流程图

Fig.1Technical flowchart of bimolecular marking methods

2双分子标记法在中药研究中的应用

2.1多来源药材的鉴别研究2010年版《中国药典》中收载140多种多来源的药材，如何科学客观地逐步解决中药材长期存在的同品名多来源问题是中药鉴别研究的重点和难点问题。对于多基原的鉴别研究，本质是解决其生物学的近缘种或相近的分类单位的鉴别问题。如贝母属植物鳞茎多做贝母用，产于浙江的浙贝母长于清肺化痰，产于四川、西藏、云南等地的川贝母长于润肺止咳，其来源复杂，鉴定难度大。

在形态学考察的前提下，可以针对特定的物种选择合适的分子标记开展多来源药材的鉴定研究。双分子标记法中的DNA分子标记能够部分完成从种及种上水平的分类和鉴别，即真伪鉴别。根据药用植物亲缘学理论，亲缘关系相近的物种不仅在形态上相似，其所含的次生代谢产物往往也比较相似。但单一或某几个化学成分往往无法完成对近缘物种的鉴别。通过代谢组学技术进行全景式扫描，可以获得用于近源物种鉴定的特异性代谢标识物或标识物组合。这些代谢标识物的确定不仅是对DNA分子标记的补充，亦避免了由于近缘物种的种质交流、谱系分选不彻底等问题导致的DNA分子标记研究中的阴性或假阳性结果。综上所述，同时运用DNA分子标记及代谢标识物双标记可以有效进行不同基原药材的鉴别研究。

2.2年限鉴别的研究中药中根、根茎类、皮类药材，如人参、三七、赤芍、龙胆、延胡索、黄芪、黄芩、黄连、苍术、厚朴、杜仲等多是多年生。其临床疗效的物质基础多为次生代谢产物，这些代谢产物的积累随时间变化呈现出一定的规律性，故药材的疗效和质量与其生长年限有着紧密的联系。

中药不同年限鉴别的本质是解决其生物学不同发育阶段的鉴别问题。目前关于年限的鉴别主要通过宏观层面的传统的器官层次的性状鉴别，如通过芦头形状和芦碗数判断人参年限等。梁加贝等^[5]通过端粒酶的长度和端粒酶活性随生长年限的变化规律建立了不同年限人参的鉴别方法。程春松等^[6]发现石柱人参及赤芍端粒均随着生长年限延长而变短，为中药年限的DNA分子鉴别研究做出了有益的尝试与探索。中药次生代谢产物的积累随时间变化呈现一定规律性，因此可以通过代谢组学技术对同一药材不同生长年限或发育阶段的代谢物成分进行分析，尝试找出合适的代谢标识物及变化规律。通过双分子标记法可以在DNA分子标记完成真伪鉴别的基础上，通过代谢标识物完成对年限的鉴定。

2.3产地的鉴别研究中药次生代谢产物的积累因环境因素不同发生变化。药材的质量因产地不同存在差异。临床用药上，历代医家习用道地药材。道地药材是指在特定自然条件、生态环境的地域所产的药材，因生产较为集中、栽培技术与采收加工有一定讲究，较同种药材其他地区所产者品质佳、疗效好。药名前标有“川”、“云”、“广”等字样，说明药材的质量与地理分布有着密切的关系。同种异地产出的药材在质量上有明显差异，导致其药效差异很大。

对于中药不同产地的鉴定研究其本质是解决其种下不同居群水平的鉴别问题。不同产地药材的鉴别中，除去传统区域性状鉴别特征外，可以利用分子谱系地理学的理论，运用DNA分子标记寻找用于产地鉴别的分子标记。但不同产地间中药的基因交流较为频繁，存在种质混杂严重现象，在一些物种中，无法寻找出能鉴别出所有产地的DNA分子标记。因此可通过代谢组学技术对不同产地药材进行分析，寻找具有产地特征的代谢标识物并研究其变化规律，结合DNA分子标记的信息与代谢产物的化学信息进行综合分析，从而达成产地鉴定的目的。

2.4优良种质研究中药中很大一部分都已引种栽培，但引种多存在盲目性，品种混乱。自留种、各地农家栽培类型构成家种中药的主要品种来源，往往造成中药产量低、质量差现象。在中药的品种改良中不仅需考虑其产量，还需考虑其有效成分的含量高低。目前中药的育种研究工作较为薄弱，仅少数几个中药有品系的系统研究，如人参^[7]（大马牙，二马牙）、地黄^[8]（北京1号，2号，金状元，85-5等）、杭菊花^[9]（大洋菊，早小洋菊，红心菊）、柴胡^[10]（中柴1号、中柴2号、中柴3号）等。双分子标记法以中药主要次生代谢产物指标性成分的组成和含量为优良种质标准，寻找与药材品质相关的DNA分子标记，筛选构建优质的中药分子标记图谱;通过代谢组学分析技术对其化学成分指标进行分析，分析中药资源的遗传差异与药材品质的相关性。从整体上评价中药不同种质间的化学差异，筛选出一批有效成分含量高的优良种质资源，为中药优良种质的鉴定、筛选及品质改良等提供科学依据和技术支持。

2.5寻找和开发新的药物资源近年来，随着回归自然理念的畅行，中医药产业兴起，对中药资源的需求愈发加大。为此应不断探索新药源，提供新药物和新产品。系统进化关系和植物化学成分分类学揭示亲缘关系越亲近的物种，其体内所含的有效化学成分越近似。通过DNA分子标记的研究可以掌握中药类群间亲缘关系，探讨其系统演化关系，完成其分子系统进化关系的研究。从而依据肖培根院士^[11]提出的药用植物亲缘学理论，再结合对中药的整体物质组成的化学表征和活性成分的测试，通过统计学的相关性分析代谢标识物的研究，寻找和扩大新药源，为开发新药提供思路。

2.6为中药的植物新品种权保护提供技术支持我国自1999年4月加入国际植物新品种保护联盟（UPOV）以后便开始受理国内外植物新品种权申请。随着我国对知识产权保护力度的不断加大和人们对于植物新品种权的日益重视，我国的植物新品种保护名录持续扩大，新品种权申请量逐年递增。然而目前我国对于中药新品种的保护力度较小，表现在列入保护名录的中药种类和申请量均很少。植物新品种权授予时考察的主要技术指标是该申请品种的特异性（distinctness）、一致性（uniformity）和稳定性（stability）（简称DUS测试）。进行DUS测试的基础是植物的性状，主要从形态学上进行考察。然而中药与其他植物相比具有自身特性：一方面，中药的不同品种不仅从形态性状上进行区分，而且更加注重其活性成分有无和含量的高低，仅用DUS测试的形态性状难以全面反映中药新品种的所有特征;另一方面，中药某些代谢产物的种类或含量具有较好的特异性，不仅能成为区别不同来源的中药，而且可以成为区别同一来源不同品种的重要指标。目前DNA分子标记技术已经成功应用于植物新品种保护中DUS测试近似品种辅助筛选和植物真实性鉴定，因此通过对中药双分子标记的研究，能弥补中药DUS测试的不足，作为DUS测试的重要补充，为中药的植物新品种权保护提供技术支持。

3小结

目前，国内外已有开始用DNA分子标记和代谢标识物来研究中药的真伪优劣，如笔者所在研究团队利用DNA分子标记成功对黄芪原植物进行了鉴别研究^[12]，以及使用AFLP技术联合GC-TOF-MS的代谢组学研究对黄芪药材的研究^[13]等。但尚未系统地提出其相关理论基础和运用方向。本文的撰写就是希望更多的研究者能开展相关工作，使双分子标记法在中药研究中发挥更大作用。

[参考文献]

[1]黄璐琦，王学勇，郭兰萍，等.中药材二维分子标记法及其构建[J].中国中药杂志，2012，37（8）：1093.

[2]崔占虎，李越，袁庆军，等.黄芪及其混伪品的ITS序列分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2012，37（24）：3773.

[3]罗焜，马培，姚辉，等.基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原原植物[J].世界科学技术——中医药现代化， 2012，14（1）：1153.

[4]朱爽，周林，庞惠敏，等.一种钩藤属植物的分子鉴定[J].中国中药杂志，2011，36（5）：535.

[5]粱加贝.不同年限人参的分子鉴别研究[D].成都：成都中医药大学， 2012.

[6]程春松.基于端粒研究的人参年限鉴定及数学模型的构建[D]. 合肥：安徽中医药大学， 2013.

[7]邵爱娟，李欣，黄璐琦，等.用RAPD技术对人参栽培群体的遗传分析[J].中国中药杂志，2004，29（11）：1033.

[8]吴志刚，王敏，黄璐琦，等.地黄不同品种遗传关系的RAPD分析[J].中国中药杂志，2007，32（18）：1865.

[9]王桃银，郭巧生.药用菊花不同栽培类型花粉形态比较研究[J].中国中药杂志，2007，32（2）：109.

[10]郑亭亭，隋春，魏建和，等.北柴胡二代新品种“中柴2号”和“中柴3号”的选育研究[J].中国中药杂志，2010，35（15）：1931.

[11]陈四保，彭勇，陈士林，等.药用植物亲缘学[J].世界科学技术——中医药现代化，2005，7（6）：97.

[12]钱丹， 陈敏， 袁庆军，等，中药黄芪原植物的分子遗传学研究及其分类地位探讨[J].药学学报，2009，44 （12）： 1429.

[13]Duan Li-xin，Chen Tian-lu， Li Ming，et al. Use of the metabolomics approach to characterize Chinese medicinal material Huangqi[J]. Mol Plant， 2015，5（2）：376.

[责任编辑吕冬梅]

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