p16和CD44v6在胃癌中的表达及其临床意义

对照。胃癌的TNM分期按照2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（UICC/AJCC）胃癌 TNM分期 标准进行。

1.2组织学检测采用常规苏木素-伊红染色。

1.3免疫组化检测 一抗分别为鼠抗人pl6单克隆抗体（稀释浓度1：100）、鼠抗人CD44v6单克隆抗体（稀释浓度1：100）及SP超敏即用型试剂盒等均由福州迈新生物技术开发公司提供。组织经10 %中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度4 um，连续切片分别做常规HE和免疫组织化学SP染色，免疫组织化主要操作步骤：严格按试剂盒说明书进行。阴性对照用PBS代替一抗，用已知的阳性组织切片作阳性对照。

1.4实验结果判定 pl6蛋白阳性着色主要定位于胞浆，部分胞核呈阳性染色，胞浆呈棕黄色或呈明显棕黄色颗粒；CD44v6蛋白蛋白主要以细胞浆出现棕黄色染色为阳性，可同时伴或不伴有胞浆弥漫性着色。镜下观察10个高倍镜视野（10×40），并根据阳性细胞占视野中癌细胞总数的比例分为（-）：细胞内无棕黄色着色，或与切片背景染色一致者；（+）：阳性细胞<25 %；（+ +）：阳性细胞为25 %-50% ；（+++）：阳性细胞>50 %。

1.5统计学处理 应用SPSS17.0版本统计学软件对结果进行分析。两样本均数比较行t检验，计数资料比较用χ2检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1胃癌按细胞分化程度分为高分化腺癌6例，中分化22例，低（未）分化65例。

2.2免疫组化结果 p16蛋白着色于癌细胞核及胞浆，CD44v6 着色于癌细胞膜。不同组织类型和分化程度的胃癌其分布方式无明显差异。93例胃癌中，p16蛋白阳性37例（39.78%），CD44v6阳性39例（41.94%）。与对照组比较，均有显著性差异（P<0.05，P<0.05）。见表1。在胃癌的阳性表达与患者性别、年龄、组织分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况的关系见表2。p16蛋白在淋巴结转移阳性组的表达率30.8%，显著低于淋巴结转移阴性组的表达率60.7%（P<0.01）。CD44v6在进展期胃癌、淋巴结转移阳性组的阳性表达率43.8%、52.3%，显著高于早期胃癌、淋巴结转移阴性组的阳性表达率9.1%、17.9%（P<0.05，P<0.01）。

2.3 CD44v6与p16的表达与患者预后的关系 p16、CD44v6的表达均与患者的预后有关，P16阳性表达者生存期≥3年及5年者分别为30.8% 、18.92%，而阴性者分别为25% 、10.71% 。CD44v6阳性表达者≥3年及5年的生存率分别为20.51%、10.26% ，而阴性者则分别是44.44% 、22.22%，见表3。但用Cox比例风险模型分析，只有P16是独立的预后因子，见表4。

2.4 CD44v6与P16表达的关系 在CD44v6呈阳性表达的37例胃癌中，P16呈阳性表达的有9例，CD44v6呈阴性表达的54例中P16呈阳性表达的有28例，经统计分析，二者在胃癌组织中表达的关系（r =-0.476，P= 0.007），说明在胃癌组织中，CD44v6的表达随着P16表达的减弱而增强，二者之间存在负相关的关系，见表5。

3 讨论

细胞之间或细胞与细胞外基质之间黏附特性的异常，是肿瘤细胞区别于正常细胞的一个重要生物学特征。这种黏附特性的异常赋予肿瘤细胞从原发部位脱落并向邻近正常组织浸润的能力，而肿瘤侵袭能力的大小是肿瘤恶性程度高低的标志之一。CD44基因于1980年由Dalchau等采用单克隆技术检测并确定的。CD44分子是细胞表面的黏附分子之一，根据基因外显子表达方式的不同编码生物学特性不同的两种蛋白：标准型（CD44s）和变异型（CD44v）。CD44s的生理功能主要是参与细胞与细胞、细胞与间质之间的粘连；介导淋巴细胞的归巢及细胞的迁移。CD44v则主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生、发展过程中[1]。CD44v的出现改变了肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能，使肿瘤细胞侵袭与转移能力增强。CD44v6是CD44的一种拼接异构体，其表达可改变肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能。CD44v6的促进转移作用机制可能是表达CD44v6的肿瘤细胞与远隔的淋巴管和血管内某一配体结合，使转移至那里的肿瘤细胞更加稳定地寄宿与生长，有效形成转移瘤。近年来通过免疫组化和原位杂交技术研究发现，CD44v6的过量表达与多种人体恶性肿瘤，如乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌等许多肿瘤的发生、发展、侵袭及转移密切相关 ，认为CD44v6可作为独立的预后指标[1，2]。较多研究资料显示：CD44v6阳性表达的肿瘤较阴性表达者恶性程度高，发展快，淋巴结转移率高，术后易复发，生存期短，预后差。本实验结果显示：CD44v6在胃癌中的阳性表达率为54% ；在胃癌侵及黏膜及黏膜下层时，即胃癌的早期，就有CD44v6的阳性表达，且其阳性表达率随胃癌的浸润深度的加深而升高，这说明CD44v6的异常表达开始于胃癌的早期，且贯穿于胃癌的整个浸润过程；其阳性表达率与淋巴转移呈正相关，提示CD44v6的阳性表达参与了转移过程。阳性者3年生存率明显低于阴性者，提示该基因的异常表达有可能成为一个较好估计预后的指标。对于CD44v6的阳性表达者，应于术后严格进行化疗，预防胃癌的复发与转移。

P16基因是1994年分离鉴定的一种新型抑癌基因， 因其对多种肿瘤有抑制作用而被命名为多肿瘤抑制基因（MTSI）。P16基因定位于人染色体9p21区域，全长8.5 kb，由2个内含子及3个外显子构成，分子量为15.85 KD，编码表达一个148个氨基酸残基的蛋白质（P16INK4）。p16基因产物作为细胞周期的负性调节成份，其功能的丧失会导致对 磷酸化抑制的解除，促使细胞增殖加快。研究发现[3-5]，P16基因及其产物在许多人类原发肿瘤和细胞株发生缺失，并导致肿瘤细胞无限制生长。本文显示，CD44v6蛋白在胃癌组织中的阳性率显著高于癌旁组织（P<0.05），而P16蛋白在胃癌组织中的阳性率显著低于癌旁组织（P<0.05）。范开席等[6]研究显示p16与胃癌组织学分化程度正相关，与浸润深度、淋巴结转移负相关，且p16阳性表达者的预后比阴性表达者好。他们的研究提示p16基因突变在胃癌中广泛存在，并参与胃癌组织分化、浸润和淋巴结转移的调节，其在胃癌的浸润、转移中发挥着重要的负性调节作用。陈广斌等[7]也得出了类似的结论，他们的结果显示伴淋巴结转移的胃癌组织中p16的表达水平明显降低，且I、II期胃癌p16阳性表达率明显高于III、Ⅳ 期，说明p16参与了胃癌的转移与进展。谭立新等[8]对p16与胃癌临床分期的进展也进行了分析，他们研究表明P16的表达水平随临床分期的进展、病情的加重而明显降低，认为P16的表达水平可作为判断肿瘤恶性程度和估计预后重要指标。杨苏敏等[9]的研究则进一步证实p16的蛋白的表达缺失不仅参与了胃癌的发生、发展过程，并认为p16可作为胃癌生物学标志之一。杨雪炎等[10]在宫颈癌中也有类似发现。

本研究显示CD44v6高表达和P16低表达与胃癌TNM分期、是否浸润浆膜、有无淋巴结转移和肝脏转移呈正相关（P<0.05），表明CD44v6和P16在胃癌的发生、临床进展和转移过程中起着重要作用。检测CD44v6和P16蛋白表达均可作为预测胃癌侵袭转移倾向及估计预后的客观指标。本研究还发现，在胃癌中CD44v6表达与P16表达呈负相关，提示p16和CD44v6在胃癌的发生、发展过程中沿着各自的方向起不同的作用，同时存在某种负性调节作用。深入探讨它们之间相互作用的机制，将对阐明肿瘤转移机制及阻断其转移途径具有重要价值。

参考文献：

[1]熊兵红，程勇.CD44与大肠癌研究的进展 [J]. 中国普通外科杂志，2007，16（7）：687-690.

[2]曲群，宗璐，杨整哉. CD44v6，CD44 CD44v7-8在宫颈癌中的表达[J].第四军医大学学报，2003，24（16）：1500-1503.

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[4]Tsujie M，Yamamoto H，Tomita N，et a1.Expression of tumor suppressor gene p16（INK4） products in primary gastric cancer[J].Ontology，2000，58（2）：126-136.

[5]刘新兰，秦景，吕怀盛，等.胃癌组织P16基因蛋白表达的意义[J].第四军医大学学报，2002，23（4）：35l-353.

[6]陈广斌，肖 鹏，白骏恒，等.p15和p16表达与胃癌及其淋巴结转移的关系[J].中华普通外科杂志，2002，17（1）：54.

[7]谭立新，林华，章平，等.P16蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义[J].中国肿瘤临床与康复，2002，9（1），38-39.

[8]范开席，王哲海，胡伟.p16、CD44V6和nm232Hl基因在胃癌中的表达[J].中华消化杂志，2001，21（3）：375-376.

[9]杨苏敏，刘玉，李丽.胃癌组织中p16和蛋白表达及意义[J].诊断病理学杂志，2003，10（1）：42-44.

[10]杨雪炎，熊兵红，马利.p16、p15及PCNA在子宫颈癌中的表达及临床意义[J].医学理论与实践，2010，23（8）：913-915.编辑/孙杰

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