黑尾近红鲌3种同工酶的组织特异性研究

材料与方法

1.1试验材料

试验用黑尾近红鲌来自国家级“湖北武汉鲌鱼良种场”。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器。北京六一DYY-6C型电泳仪电源、北京六一DYCZ-24A型双垂直电泳槽、北京六一WD-9405B型脱色摇床、上海恒平JY6002型电子天平、德国Eppondorf公司5810R型台式高速冷冻离心机玻璃制匀浆器。

1.2.2试剂。丙烯酰胺、N，N′—甲叉双丙烯酰胺、TEMED催化剂、过硫酸铵、溴酚蓝、缓冲液和染色液相关试剂。

1.3方法

1.3.1样品液的制备。

对黑尾近红鲌采用断鳃放血方法致死，在冰浴条件下取出其肝、肾、心、脑、肌和眼6种组织并洗净。在冰上进行组织匀浆，匀浆缓冲液为pH 7.0、浓度 0.1 mol/L磷酸缓冲液，将已匀好的匀浆液在4 ℃条件下静置1 h后，15 000 r/min、4 ℃下离心20 min后取上清液，置于-20 ℃条件下保存备用。

1.3.2聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，凝胶制备参照《现代分子生物学实验技术》，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸溶液，在4 ℃条件下进行预电泳30 min。

经预电泳后，以5∶1的比例混合的酶液和溴酚蓝指示剂，用微量取液器取50 μl混合好的酶液加入点样孔。在4 ℃条件下正式电泳，当样品在浓缩胶迁移时电压控制为50 V，等到样品进入分离胶后电压升至200 V，直至溴酚蓝指示剂距分离胶底部1 cm时停止电泳。

1.3.3染色和固定。

乳酸脱氢酶、酯酶和苹果酸脱氢酶3种酶的染色方法分别参照张庆朝、赵赣等[10-11]。将凝胶于37 ℃染色液中避光染色，显色完成后，将凝胶板用去离子水漂洗2～3次，在7%的冰醋酸溶液中固定，对染色和固定好的凝胶板用相机进行拍照并进行分析。

2结果与分析

2.1乳酸脱氢酶（LDH）

目前，已知编码鱼类的LDH同工酶基因座包含3个位点，存在多种形式，其中LDH-C位点编码单独编码C蛋白且靠近阴极[12]。从图1可以看出，黑尾近鲌LDH同工酶活性具有组织特异性，在肾、心、脑、肌、眼组织中均可见5条酶带，其中LDH-B4在心脏和脑中优势表达，LDH-A4在肌肉中优势表达，而LDH-C只在肝脏中检测到，这种特异性与不同组织的相应生理功能密切相关。

2.2酯酶（EST）

鱼类酯酶比较复杂，以单体酶或多聚体酶等形式存在，且其编码基因位点较多，呈现出普遍的多态性。从图2可以看出，EST在黑尾近红鲌的6种组织中均有分布，在肾、心和肝中活性较强，其中脑和肝组织有6条带，肾组织有5条带，这3种组织中的酯酶分布形式最多。

2.3苹果酸脱氢酶（MDH）

MDH同工酶在鱼类以二聚体形式存在，包括细胞质型（s-MDH）和线粒体型（m-MDH）2种类型，且均由2个基因位点编码[14]。从图3可以看出，黑尾近红鲌的m-MDH在心脏中表现为典型的二聚体2条酶带，在脑和肌中亦有分布。s-MDH在6种组织都有分布，其中肝、肾、心和脑均为2条酶带，而其他组织为1条酶带，尤其在肝、肾及脑中表达活性最强。

3讨论

该试验结果表明黑尾近红鲌的6种组织中3种同工酶在组成和活性上表现出明显的组织特异性，这与相应组织器官的生理功能密切相关[15]。黑尾近红鲌同工酶组织特异性主要表现在以下方面：①同工酶表达的位点多态性，某些位点的同工酶仅在特定组织表达；②同工酶表达强弱不同，主要表现在同一位点不同组织的表达强弱不一样；③同工酶表达的等位基因不同，同一位点的在不同组织中会有不同的同工酶。

LDH是糖酵解过程中的重要酶，可将无氧下产生的丙酮酸还原为乳酸并产能供机体所需。鱼类的LDH同工酶研究比较深入，已证明LDH是四聚体，编码鱼类的LDH同工酶基因座包含3个位点，分别为LDHA、LDHB、LDHC，通常情况下四聚体LDH由A、B 2个亚基组合成5种同工酶，分别为B4、AB3、A2B2、A3B、A4，B亚基迁移速率大于A亚基，C位点编码的蛋白质电荷与A、B不同且靠近阴极。LDHB4主要位于好氧性器官组织（如心脏）中，LDHA4主要位于厌氧性器官组织肌肉中。该研究中的黑尾近红鲌肌肉组织中的LDHA4表达要强于其他组织，这与晁珊珊等[16]对齐口裂腹鱼研究结果及马波等[17]对兴凯湖翘嘴红鲌研究结果类似。C位点编码的蛋白在鱼眼中首先被发现，随后在一些鱼类肝脏中也发现C位点的表达。该研究中LDH-C仅在黑尾近红鲌肝脏中特异性表达，可能与其肝脏代谢旺盛密切相关。在对翘嘴鲌、蒙古红鲌、青梢红鮊及海南红鲌[17-19]的研究中也发现肝脏具有C酶带。

EST是一种水解类酶，可催化酯类化合物的水解，参与能量代谢，还可代谢大量非正常存在的酯类，起到解毒功能。一般认为，在硬骨鱼类中EST是以单体或二聚体形式存在，由多个位点编码，存在多态现象。鱼类肝和肾等组织不仅作为主要的能量代谢组织，也是重要解毒组织。该研究中黑尾近红鲌肾脏、肝脏及心脏中EST的含量比较丰富，这与其提供能量并降解代谢废物、毒素等复杂的生理功能相适应，在淡水黑鲷、白甲鱼[14]、岩原鲤 、刺鲤研究中有着相似的结果。

MDH是生物氧化重要酶类，其负责使苹果酸脱氢为草酰乙酸参与糖酵解后的有氧代谢[13，22]；因此MDH在一些有氧代谢旺盛的组织（如肝、肾等）中含量丰富、染色深。黑尾近红鲌中的MDH存在细胞质型（sMDH）和线粒体型（mMDH）2种，在对褐点石斑鱼[22]和松江鲈鱼研究中也发现存在2种类型的MDH。这2种MDH都是在黑尾近红鲌肝脏和心脏中染色较深，这与其有氧代谢旺盛有着密切关联性。

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